Изменения протеома фибробластов и эндотелиальных клеток при инкубации с субвирусными плотными тельцами цитомегаловируса человека - Хайнаньская компания пропановой группы, ООО

Научные данные, том 10, Номер статьи: 517 (2023) Цитировать эту статью

Подробности о метриках

Цитомегаловирус человека (ЦМВВ) является патогеном, имеющим высокую медицинскую значимость. Субвирусные плотные тельца (DB) были разработаны в качестве кандидатной вакцины для смягчения тяжелых последствий инфекции ЦМВ. Разработка такой кандидатной вакцины для применения у человека требует детальных знаний о ее взаимодействии с хозяином. Проведен комплексный масс-спектрометрический (МС) анализ изменений протеома клеток клеточной культуры, подвергшихся воздействию БД.

Цитомегаловирус человека (ЦМВВ) представляет собой β-герпесвирус и является основной причиной врожденных инфекций во всем мире, приводящих к ряду последствий, таких как потеря слуха, нарушение зрения или когнитивные расстройства1. В контексте системной иммуносупрессии инфекция ЦМВИ может привести к значительной заболеваемости и смертности1. Фибробласты, инфицированные ЦМВ, выделяют большое количество неинфекционных частиц, называемых плотными тельцами, в супернатант клеточной культуры2,3. Масс-спектрометрический анализ выделенных ДБ способствовал выяснению их белкового состава и выявил наличие важных антигенов адаптивного иммунного ответа против HCMV4,5. Между тем, эксперименты in vitro и исследования на животных показали, что DB особенно иммуногенны и вызывают сильный ответ интерферона (IFN)6,7,8,9,10,11. Следовательно, DB рассматривается как многообещающая вакцина против HCMV12,13. Что касается применения кандидатной вакцины на людях в клинических испытаниях и для окончательного лицензирования, всесторонние знания о влиянии вакцины на клетки-хозяева важны для оценки потенциальных побочных эффектов и переносимости. Наборы данных о влиянии БД на культуральные фибробласты и эндотелиальные клетки были получены с помощью масс-спектрометрии (МС). Эти наборы данных были использованы в предыдущей публикации, посвященной изучению реакции интерферона-β и индукции экспрессии стимулируемого интерфероном гена (ISG) в фибробластах и эндотелиальных клетках при воздействии DB11.

Первичные фибробласты крайней плоти человека (HFF) были выделены из крайней плоти новорожденного ребенка в 1994 году и использовались для исследований в прошлом6,7,14,15,16. Разрешение на использование этих клеток для исследований было получено от комитета по этике медицинского совета земли Рейнланд-Пфальц, Германия. HFF поддерживали в минимальной необходимой среде (MEM; Gibco-BRL, Глазго, Шотландия), дополненной 5% фетальной телячьей сывороткой (FCS), 100 мг/л L-глутамина, 0,5 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF, Invitrogen, Карлсруэ, Германия) и гентамицин (5 мг/л). Для экспериментов использовали числа пассажей клеток HFF от 16 до 19. Клетки HEC-LTT были созданы Дагмар Вирт и ее коллегами17. Клетки были получены из эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC), которые были условно иммортализованы с помощью тетрациклин-зависимой экспрессии большого Т-антигена SV40 и обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT). Для культивирования культуральные сосуды покрывали 0,1% желатином (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) по меньшей мере на 30 минут. Клетки HEC-LTT поддерживали в среде для роста эндотелия (EGM BulletKit; Lonza Sales Ltd., Базель, Швейцария), дополненной 2 мкг/мл доксициклина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури). Пролиферацию клеток HEC-LTT можно контролировать с помощью доксициклина (DOX). Добавление DOX активирует экспрессию иммортализующих белков hTERT и большого Т-антигена SV40, что приводит к пролиферации клеток. Доксициклин отсутствовал во время всех экспериментов. Разрешение на использование клеток HEC-LTT в исследовательских целях было предоставлено Центром исследований инфекций имени Гельмгольца (HZI) по соглашению о передаче материала. Было показано, что клетки допускают инфекцию ЦМВ18. HEC-LTT были любезно отправлены нам Кристианом Зинцгером (Институт вирусологии, Медицинский центр Ульмского университета, Ульм, Германия) и использовались для экспериментов с пассажа 41 по пассаж 55.

1.0-fold with p-value < 0.05 (green dots), and 35 proteins that were decreased by < − 1.0-fold with p-value < 0.05, (red dots). The HCMV tegument protein pp65 (UL83) is highlighted in orange and its detection was used as a positive control, indicating DB internalisation into HFF. The volcano plot was generated using the R software. (b + c) Protein-Protein Interaction (PPI) analysis and functional classification of the regulated proteins in HFF after DB-stimulation. (b) Display of the STRING PPI network generated upon entering the 68 regulated proteins into the STRING database. The network nodes represent all the proteins produced by a single protein-coding gene locus. Nodes are coloured according to their function in the indicated biological processes in c. Grey nodes indicate proteins connected to the input proteins but without association with the biological processes. Connections reflect protein interaction and the line thickness indicates strength of the data support, using a high confidence cut-off with a score of 0.7. Proteins with no interaction to other proteins in the network were removed. (c) Bar chart of the biological processes, connected to the proteins that were found to be regulated in HFF after DB-stimulation. The arrangement was performed according to increasing False Discovery Rates (FDR). The y-axis represents biological process categories, while the x-axis indicates the number of genes involved in each category. (d) Heatmap of the 45 altered ISGs. The expression patterns were arranged hierarchically based on the mean of the log2 converted normalized ratio from 5 biological replicates. The log2FC is represented with a colour gradient. IFN, Interferon; ISG, Interferon-stimulated gene; STRING, Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes./p> 1.0; p < 0.05). Blue dots indicate differentially expressed proteins that were significantly upregulated (fold change < 1.0; p < 0.05). The viral tegument protein pp65 (UL83) is highlighted in orange and was used as a control for DB internalisation into ECs. The volcano plot was generated using the R software. (b) STRING Protein-Protein Interaction network of the 83 proteins that were differentially expressed in ECs upon DB treatment. Proteins with no associations to other proteins in the network were removed. Network nodes represent all the proteins produced by a single, protein-coding gene locus. Lines depict protein interaction and the line thickness indicates the strength of the data support with a minimum confidence cut-off of 0.7 (high confidence). (c) Bar chart of the enriched biological processes associated with differentially expressed proteins. The top ten enriched biological processes are arranged according to increasing False Discovery Rates (FDR). The y-axis represents biological process categories, while the x-axis indicates the number of genes involved in each category. (d) 60 differentially regulated proteins were designated as IRGs. The log2FC is represented with a colour gradient. The 20 up-regulated ISGs are indicated in blue and the 40 down-regulated ISGs are indicated in red. STRING, Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes./p>